Ферменты. Особенности ферментативного катализа. Строение и структура ферментов. Механизм и стадии ферментативного катализа: теории Фишера, Кошланда, переходных состояний Типы ферментативных реакций

Механизм действия ферментов может быть рассмотрен с двух позиций: с точки зрения изменения энергетики химических реакций и с точки зрения событий в активном центре.

А. Энергетические изменения при химических реакциях

Любые химические реакции протекают, подчиняясь двум основным законам термодинамики: закону сохранения энергии и закону энтропии. Согласно этим законам, общая энергия химической системы и её окружения остаётся постоянной, при этом химическая система стремится к снижению упорядоченности (увеличению энтропии). Для понимания энергетики химической реакции недостаточно знать энергетический баланс входящих и выходящих из реакции реагентов, необходимо учитывать изменения энергии в процессе данной химической реакции и роль ферментов в динамике этого процесса. Рассмотрим реакцию разложения угольной кислоты:

Н2СО3 → Н20 + С02.

Угольная кислота слабая; реакция её разложения пойдёт цри обычных условиях, если молекулы угольной кислоты имеют энергию, превышающую определённый уровень, называемый энергией активации Еа (рис. 2-10).

Энергией активации называют дополнительное количество кинетической энергии, необходимое молекулам вещества, чтобы они вступили в реакцию.

При достижении этого энергетического барьера в молекуле происходят изменения, вызывающие перераспределение химических связей и образование новых соединений. Говорят, что молекулы, обладающие Еа, находятся в переходном состоянии. Разницу энергий между исходным реагентом Н2СО3 и конечными соединениями Н2О и СО2 называют изменением свободной энергии реакции DG. Молекулы Н2О и СО2 - более стабильные вещества, чем Н2СО3, т.е. обладают меньшей энергией и при обычных условиях практически не реагируют. Выделившаяся энергия в результате этой реакции рассеивается в виде тепла в окружающую среду.

Чем больше молекул обладает энергией, превышающей уровень Еа, тем выше скорость химической реакции. Повысить скорость химической реакции можно нагреванием. При этом увеличивается энергия реагирующих молекул. Однако для живых организмов высокие температуры губительны, поэтому в клетке для ускорения химических реакций используются ферменты. Ферменты обеспечивают высокую скорость реакций при оптимальных условиях, существующих в клетке, путём понижения уровня Еа. Таким образом, ферменты снижают высоту энергетического барьера, в результате возрастает количество реакционно-способных молекул, следовательно, увеличивается скорость реакции.

В механизме ферментативного катализа решающее значение имеет образование нестойких промежуточных соединений - фермент-субстратный комплекс ES, подвергающийся превращению в нестабильный переходный комплекс ЕР, который почти мгновенно распадается на свободный фермент и продукт реакции.

Таким образом, биологические катализаторы (ферменты) не изменяют свободную энергию.

Фермент, выполняя функцию катализатора химической реакции, подчиняется общим законам катализа и обладает всеми свойствами, характерными для небиологических катализаторов, однако имеет и отличительные свойства, связанные с особенностями строения ферментов.

Сходство ферментов с небиологическими катализаторами заключается в том, что:

·ферменты катализируют энергетически возможные реакции;

·энергия химической системы остаётся постоянной;

·в ходе катализа направление реакции не изменяется;

·ферменты не расходуются в процессе реакции.

Отличия ферментов от небиологических катализаторов заключаются в том, что:

·скорость ферментативных реакций выше, чем реакций, катализируемых небелковыми катализаторами;

·ферменты обладают высокой специфичностью;

·ферментативная реакция проходит в клетке, т.е. при температуре 37 °С, постоянном атмосферном давлении и физиологическом значении рН;

·скорость ферментативной реакции может регулироваться.

Механизмы действия ферментов

В общем виде все сводится к комплементарному взаимодействию фермента и субстрата. При этом функциональные группы субстрата взаимодействуют с соответствующими им функциональными группами фермента. Наличие субстратной специфичности объясняют две гипотезы:

1. Теория Фишера (модель "жесткой матрицы", "ключ-замок") – активный центр фермента строго соответствует конфигурации субстрата и не изменяется при его присоединении. Эта модель хорошо объясняет абсолютную специфичность, но не групповую.

2. В 1958 г. Дениел Кошланд предложил модификацию модели «ключ-замок». Ферменты, в основном, - не жесткие, а гибкие молекулы. Активный центр фермента может изменить конформацию после связывания субстрата. Боковые группы аминокислот активного центра принимают такое положение, которое позволяет ферменту выполнить свою каталитическую функцию. В некоторых случаях молекула субстрата также меняет конформацию после связывания в активном центре. В отличие от модели «ключ-замок», модель индуцированного соответствия объясняет не только специфичность ферментов, но и стабилизацию переходного состояния. Эта модель получила название «рука-перчатка».

Кинетика ферментативных реакций. Зависимость скорости ферментативных реакций от температуры, рН среды, концентраций фермента, субстрата. Понятие об оптимумах рН и температуры, физиологическое и клинико-диагностическое значение. Определение константы Михаэлиса и ее клинико-диагностическое значение.

Кинетикаферментативной реакции (т. е. зависимость скорости реакции от ее условий) определяется в первую очередь свойствами катализатора .

Ферментативная кинетика занимается исследованием закономерностей влияния химической природы реагирующих веществ (ферментов, субстратов) и условий их взаимодействия (концентрация, рН среды, температуры, присутствие активаторов или ингибиторов) на скорость ферментативной реакции. Главной целью изучения кинетики ферментативных реакцийявляется получение информации, которая может способствовать выяснению молекулярного механизма действия фермента.

Зависимость скорости ферментативной реакции от количества ферментов:

При проведении ферментативной реакции в условиях избытка субстрата скорость реакции будет зависеть от концентрации фермента. Графическая зависимость такой реакции имеет вид прямой линии.Однако количество фермента часто невозможно определить в абсолютных величинах, поэтому на практике пользуются условными величинами, характеризующими активность фермента: одна международная единица активности (ME) соответствует такому количеству фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата за 1 мин при оптимальных условиях проведения ферментативной реакции. Оптимальные условия индивидуальны для каждого фермента и зависят от температуры среды, рН раствора, при отсутствии активаторов и ингибиторов.

Рис. Зависимость накопления продукта (А) и убыли субстрата (Б) от времени (продолжительности) протекания реакции. Скорость ферментативной реакции определяется изменением концентрации продукта или субстрата за единицу времени.

Период ферментативной реакции характеризуется нелинейным накоплением продукта (или убылью субстрата) в зависимости от времени реакции.

единица активности ферментов: 1 катал (кат), соответствующий такому количеству катализатора, которое превращает 1 моль субстрата за 1 с. Количество каталов определяют по формуле:

Международная единица ферментативной активности ME связана с каталом следующими равенствами:

1 кат = 1 моль S/c = 60 моль S/мин = 60х10 6 мкмоль/мин = 6х10 7 ME,

1 ME = 1 мкмоль/мин = 1/60 мкмоль/с = 1/60 мккат = 16,67 нкат.

В медицинской практике для оценки активности ферментов часто используют международные единицы активности - ME. Для оценки количества молекул фермента среди других белков данной ткани определяют удельную активность (уд. ак.) фермента, численно равную количеству единиц активности фермента (пМЕ) в образце ткани, делённому на массу (мг) белка в этой ткани:

По удельной активности судят об очистке фермента: чем меньше посторонних белков, тем выше удельная активность.

Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры среды

Повышение температуры до определённых пределов оказывает влияние на скорость ферментативной реакции, подобно влиянию температуры на любую химическую реакцию. С повышением температуры ускоряется движение молекул, что приводит к повышению вероятности взаимодействия реагирующих веществ. Кроме того, температура может повышать энергию реагирующих молекул, что также приводит к ускорению реакции. Однако скорость химической реакции, катализируемая ферментами, имеет свой температурный оптимум, превышение которого сопровождается понижением ферментативной активности, возникающим из-за термической денатурации белковой молекулы.

Для большинства ферментов человека оптимальна температура 37-38 °С. Однако в природе существуют и термостабильные ферменты. Например, Taq-полимераза, выделенная из микроорганизмов, живущих в горячих источниках, не инактивируется при повышении температуры до 95 °С. Этот фермент используют в научно-практической медицине для молекулярной диагностики заболеваний с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Рис. Зависимость скорости ферментативной реакции (V) от температуры.

Зависимость скорости ферментативной реакции от рН среды

Для каждого фермента существует значение рН, при котором наблюдается его максимальная активность. Отклонение от оптимального значения рН приводит к понижению ферментативной активности.

Влияние рН на активность ферментов связано с ионизацией функциональных групп аминокислотных остатков данного белка, обеспечивающих оптимальную конформацию активного центра фермента. При изменении рН от оптимальных значений происходит изменение ионизации функциональных групп молекулы белка. Например, при закислении среды происходит протонирование свободных аминогрупп (NH 3 +), а при защелачивании происходит отщепление протона от карбоксильных групп (СОО -). Это приводит к изменению конформации молекулы фермента и конформации активного центра; следовательно, нарушается присоединение субстрата, кофакторов и коферментов к активному центру. Кроме того, рН среды может влиять на степень ионизации или пространственную организацию субстрата, что также влияет на сродство субстрата к активному центру. При значительном отклонении от оптимального значения рН может происходить денатурация белковой молекулы с полной потерей ферментативной активности.

Оптимум значения рН у разных ферментов различный. Ферменты, работающие в кислых условиях среды (например, пепсин в желудке или лизосомальные ферменты), приобретают конформацию, обеспечивающую работу фермента при кислых значениях рН. Однако большая часть ферментов организма человека имеет оптимум рН, близкий к нейтральному, совпадающий с физиологическим значением рН.

Зависимость скорости ферментативной реакции от количества субстрата

Если концентрацию ферментов оставить постоянной, изменяя только количество субстрата, то график скорости ферментативной реакции описывают гиперболой.

При увеличении количества субстрата начальная скорость возрастает. Когда фермент становится полностью насыщенным субстратом, т.е. происходит максимально возможное при данной концентрации фермента формирование фермент-субстратного комплекса, наблюдают наибольшую скорость образования продукта. Дальнейшее повышение концентрации субстрата не приводит к увеличению образования продукта, т.е. скорость реакции не возрастает. Данное состояние соответствует максимальной скорости реакции V max .

Таким образом, концентрация фермента - лимитирующий фактор в образовании продукта. Это наблюдение легло в основу ферментативной кинетики, разработанной учёными Л. Михаэлисом и М. Ментен в 1913 г.

Ферментативный процесс можно выразить следующим уравнением:

где k 1 - константа скорости образования фермент-субстратного комплекса; k -1 - константа скорости обратной реакции, распада фермент-субстратного комплекса; k 2 - константа скорости образования продукта реакции.

Следующее соотношение констант скоростей (k -1 + k 2)/k 1 называют константой Михаэлиса и обозначают К m .

Скорость реакции пропорциональна концентрации фермент-субстратного комплекса ES, a скорость образования ES зависит от концентрации субстрата и концентрации свободного фермента. На концентрацию ES влияет скорость формирования и распада ES.

Наибольшая скорость реакции наблюдается в том случае, когда все молекулы фермента находятся в комплексе с субстратом, т.е. в фермент-субстратном комплексе ES, т.е. [Е] = .

Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата выражается следующим уравнением

Это уравнение получило название уравнения Михаэлиса-Ментен.

В случае, когда скорость реакции равна половине максимальной, K m = [S] Таким образом, константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата, при которой достигается половина максимальной скорости.

Уравнение Михаэлиса-Ментен - основное уравнение ферментативной кинетики, описывающее зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата.

Если концентрация субстрата значительно больше K m (S >> K m), to увеличение концентрации субстрата на величину К m практически не влияет на сумму (K m + S) и её можно считать равной концентрации субстрата. Следовательно, скорость реакции становится равной максимальной скорости: V = V max . В этих условиях реакция имеет нулевой порядок, т.е. не зависит от концентрации субстрата. Можно сделать вывод, что V max - величина постоянная для данной концентрации фермента, не зависящая от концентрации субстрата.

Если концентрация субстрата значительно меньше K m (S << K m), то сумма (K m + S) примерно равна К m , следовательно, V = V max [S]/K m , т.е. в данном случае скорость реакции прямо пропорциональна концентрации субстрата (реакция имеет первый порядок).

Рис. Зависимость скорости реакции (V) от концентрации субстрата S.

V mах и K m - кинетические характеристики эффективности фермента.

· V max дает характеристику каталитической активности фермента и имеет размерность скорости ферментативной реакции моль/л, т.е. определяет максимальную возможность образования продукта при данной концентрации фермента и в условиях избытка субстрата. К m характеризует сродство данного фермента к данному субстрату и является величиной постоянной, не зависящей от концентрации фермента. Чем меньше

· К m , тем больше сродство фермента к данному субстрату, тем выше начальная скорость реакции и наоборот, чем больше К m , тем меньше начальная скорость реакции, тем меньше сродство фермента к субстрату.

Ферменты играют ключевую роль в метаболизме. Они ускоряют реакции, увеличивая их константы скоростей.

Рассмотрим энергетический профиль обычной реакции (рис. 12.I), проходящей в растворе по механизму столкновений А + В -> Р.

Образование продукта Р происходит, если энергия сталкивающихся молекул исходных веществ А и В превышает величину энергетического барьера. Очевидно, что можно ускорить эту реакцию, если каким-то образом уменьшить энергию активации &.Е ЗКГ

Общая схема ферментативной реакции, включает, как известно, образование единого фермент-субстратного комплекса, в активном центре которого и происходит разрыв старых и образование новых связей с появлением продукта.

В различных теоретических моделях механизма действия ферментов предлагаются разные способы понижения барьера реакции в фермент-субстратном комплексе. В результате фиксации субстрата на ферменте происходит некоторое снижение энтропии реагентов по сравнению с их свободным состоянием. Само по себе это облегчает дальнейшие химические взаимодействия между активными группами в фермент-субстратном комплексе, которые должны быть взаимно строго ориентированы. Предполагается также, что избыток энергии сорбции, который выделяется при связывании субстрата,

Рис. 12.1.

не переходит полностью в тепло. Энергия сорбции может быть частично запасена в белковой части фермента, а затем сконцентрироваться на атакуемой связи в области образовавшихся фермент-субстратных контактов.

Таким образом, постулируется, что энергия сорбции идет на создание низкоэнтропийной энергетически напряженной конформации в фермент-субстратном комплексе и тем самым способствует ускорению реакции. Однако экспериментальные попытки обнаружить упругие деформации, которые могли бы храниться в белковом глобуле фермента, не диссипируя в тепло в течение достаточно длительного времени между каталитическими актами (10 10 -3 с), не увенчались успехом. Более того, необходимая для

катализа взаимная ориентация и сближение расщепляемой связи субстрата и активных групп в центре фермента происходят спонтанно, вследствие внутримолекулярной подвижности разных, в том числе и активных, групп фермента и субстрата. Такое сближение не требует образования каких-либо энергетически неблагоприятных контактов. Этот вывод следует из анализа невалентных взаимодействий в активных центрах ряда ферментов (а-химотрипсин, лизоцим, рибонуклеаза, карбоксинептидаза). Таким образом, сама по себе напряженность конформации в фермент-субстратном комплексе не является необходимым источником энергии и движущей силой катализа.

В других моделях высказывается предположение о том, что в белковой глобуле происходит бездиссипативная передача энергии тепловых колебаний от наружных слоев белка к атакуемой связи в активном центре. Однако никаких серьезных доказательств этому нет, кроме утверждения о том, что фермент должен быть «устроен» так, чтобы его структура обеспечивала когерентный характер распространения флуктуационных изменений конформации без тепловых потерь по определенным степеням свободы.

Помимо отсутствия экспериментальных доказательств общим недостатком этих моделей является то, что в них не учитывается в явном виде важный фактор - спонтанная внутримолекулярная подвижность белка.

Шаг вперед в этом отношении сделан в конформационно-ре- лаксапионной концепции ферментативного катализа. В ней появление продукта рассматривается как результат последовательных конформационных изменений в фермент-субстратном комплексе, индуцированных первоначальными изменениями электронного состояния в активном центре фермента. Вначале, в течение короткого времени (10 |2 - 10 13 с), происходят электронно-колебательные взаимодействия, затрагивающие только выделенные химические связи субстрата и функциональные группы фермента, но не остальную часть белковой глобулы.

Вследствие этого создается конформационно-неравновесное состояние, которое релаксирует к новому равновесию с образованием продукта. Процесс релаксации происходит медленно и носит направленный характер, включая стадии отщепления продукта и релаксации свободной молекулы фермента к исходному равновесному состоянию. Координата ферментативной реакции совпадает с координатой конформационной релаксации. Температура же влияет на конформационную подвижность, а не на число активных соударений свободных молекул реагентов, что просто не имеет места в уже сформированном фермент-субстратном комплексе.

Вследствие больших различий в скоростях можно рассматривать отдельно быстрые электронные взаимодействия в активном центре, осуществляющиеся на коротких расстояниях, и более медленные конформационно-динамические изменения в белковой части.

На первом этапе катализа стохастический характер динамики белковой глобулы фермента и диффузии субстрата к активному центру приводят к образованию строго определенной конфигурации, включающей функциональные группы фермента и химические связи субстрата. Например, в случае гидролиза пептидной связи для реакции необходима одновременная атака субстрата двумя группами активного центра - нуклеофильной и электрофильной.

Пример 12.1. На рис. 12.2 приведено взаимное расположение расщепляемой пептидной связи субстрата и боковых цепей сер- 195, гис-51. Атом остатка сер-195 находится на расстоянии 2,8 А против карбонильного углерода С 1 , а протон гидроксильной группы, не нарушая водородной связи с атомом N гис-51 , располагается на расстоянии 2,0 А над атомом азота расщепляемой группы. При возникновении такой и только такой конфигурации происходит химический акт катализа. Формально это соответствует одновременному соударению нескольких молекул, что в растворе крайне маловероятно.

Возникает вопрос: какова вероятность спонтанного формирования такого рода реакционноспособной конфигурации в плотно структурированной среде за счет конформационных флуктуаций нескольких групп, происходящих по законам ограниченной диффузии?

Расчеты показывают, что существует вполне определенная вероятность одновременного попадания нескольких групп в «реакционную»

Рис. 12.2.

область некоторого радиуса, где они оказываются сближенными на короткие расстояния. Эта вероятность зависит главным образом от коэффициента диффузии и числа степеней свободы функциональных групп, «ищущих» друг друга в ограниченном пространстве. Например, при гидролизе пептидной связи необходимо создать благоприятную ориентацию для двух групп активного центра относительно определенных участков субстрата. Каждая из групп обладает тремя степенями свободы, а с учетом вибраций молекулы субстрата общее число степеней свободы N - 6 - 7. Это типично для ферментативных процессов.

Оказывается, что в обычных условиях среднее время образования такой активной конфигурации составляет т ~

10 2 - 1СИс, что совпадает с временами оборота фермента в условиях субстратного насыщения. В растворе для аналогичной реакции это время намного больше даже при значительных коэффициентах диффузии. Причина состоит в том, что, попав в ограниченную область в плотно структурированной среде, функциональные группы «находят» друг друга и сближаются на короткие расстояния раньше, чем они «разбегутся» в разные стороны, как это происходит в растворе. Вместе с тем величина т - 10~ 2 - 1СНс намного больше, чем времена релаксаций отдельных групп, что является следствием достаточно жестких стерических условий для протекания реакции. Увеличение числа функциональных групп и необходимых одновременных контактов между ними приводит к увеличению времени достижения многоцентровой активной конфигурации. Общая скорость ферментативного катализа определяется именно временем образования нужной конформации при спонтанном сближении соответствующих групп в активном центре. Следующие за этим электронные взаимодействия происходят гораздо быстрее и не лимитируют общую скорость катализа.

Существует ряд особенностей ферментов, облегчающих превращение субстрата в активном центре. Как правило, микросреда активного центра с его аминокислотными остатками более гидро- фобна, чем окружающая водная среда. Это снижает значение диэлектрической постоянной активного центра (е

Высокая локальная концентрация диполей пептидных связей создает в активном центре электрические поля напряженностью порядка тысяч и сотен тысяч вольт на сантиметр. Таким образом, ориентированные полярные группы создают внутриглобулярное электрическое поле, влияющее на кулоновские взаимодействия в активном центре.

Механизмы самих электронных переходов в активной конфигурации требуют для своей расшифровки привлечения методов квантовой химии. Перекрывание электронных орбиталей может привести к перераспределению электронной плотности, появлению дополнительного заряда на разрыхляющей орбитали атакуемой связи в субстрате и ее ослаблению.

Именно это и происходит при гидролизе пептидной связи в тетраэдрическом комплексе (см. рис. 12.2). Стекание электронной плотности от Ofoj-cep-195 на разрыхляющую орбиталь в пептидной связи происходит за счет взаимодействия неподеленной пары электронов 0[ 95 5 с я-электронами атома С 1 пептидной связи. При этом нело- деленная пара азота аминной группы выталкивается из пептидной

Рис. 12.3.

связи N=C", которая утрачивает двойной характер и в результате ослабляется.

Одновременно отекание электронной плотности от 0,95 ослабляет и связь Н-О^. Но тогда облегчается взаимодействие Н фермента и N аминной группы и ее протонирование с переходом протона от 0"[ ч5 к гис-57. В свою очередь это опять увеличивает взаимодействие Oj9 5 c пептидной группой и т.д.

Таким образом, в тетраэдическом комплексе создается уникальная ситуация, когда несколько мономолекулярных реакций протекают одновременно, взаимно ускоряя друг друга. Синхронное перемещение заряда и протона между сер- 195, гис-57, пептидной связью обеспечивает высокую эффективность процесса. Каталитический акт сводит в единую кооперативную систему три отдельные бимолекулярные реакции, ведущие к разрыву пептидной связи - событию, маловероятному в растворе. В системе индицируются естественные конформационные перестройки и в итоге происходит деацилирова- ние фермента и протонирование атома 0} 95 .

Принцип образования полифункциональной замкнутой системы атомных групп в активной конфигурации выполняется и в других фермент-субстратных комплексах (рис. 12.3).

В ферментативном катализе многостадийный характер превращений субстрата, маловероятный в растворе, обеспечивается за счет синхронного кооперативного их протекания в единой полифункцио- нальной системе.

Замена малоэффективных последовательных активационных стадий скоординированным процессом приводит формально к снижению энергии активации всей реакции. Заметим еще раз, что, строго говоря, физический смысл понятия «энергия активации» в ферментативных процессах не соответствует таковому для реакций в растворах, идущих по механизму активных столкновений свободных молекул.

1) Эффект концентрирования – это адсорбирование на поверхности молекулы фермента молекул реагирующих веществ, т.е. субстрата, что приводит к их лучшему взаимодействию. Пр.: электростатическое притяжение – скорость реакции может возрасти в 10 3 раз.

2) Эффект ориентации – это специфическое связывание субстрата с контактными участками активного центра фермента, которое обеспечивает взаимную ориентацию молекул субстрата и их сближение для более выгодного воздействия каталитических групп в активном центре. За счет эффекта ориентации скорость реакции возрастает в 10 3 -10 4 раз. [рис. эффекта ориентации: поворот двух кругов вырезами друг к другу]

3) Эффект натяжения (теория «дыбы»). Субстрат до присоединения к ферменту находится в расслабленной конформации, а после связывания с ферментом деформируется или растягивается. Места деформации легче атакуются каталитическим центром фермента. [рис. эффекта дыбы: субстрат растягивается над ферментом]

4) Эффект вынужденного соответствия (прилегания). Не только субстрат претерпевает изменение конформации, но и фермент, особенно в активном центре, после связывания субстрата меняет свою конформацию, которая становится более комплементарной субстрату.

Теория Фишера: фермент подходит к субстрату как ключ к замку.

Теория Котланда: фермент и субстрат взаимодействуют между собой по принципу рука–перчатка. Истинная комплементарность фермента к субстрату достигается после изменения конформации и субстрата и фермента.

Теория кислотно-основного катализа

В составе активного центра фермента имеются как кислые, так и основные функциональные группы. В результате этого фермент проявляет в ходе катализа кислотно-основные свойства, т.е. играет как роль донора, так и роль акцептора протонов. Кислотно-основной катализ характерен для гидролаз, лиаз, изомераз.

При закреплении субстрата в активном центре на его молекулу влияют электрофильные и нуклеофильные группы каталитического участка, что вызывает перераспределение электронной плотности в субстрате. Такое перераспределение облегчает перестройку и разрыв связей в молекуле субстрата.

Пр.: Реакция превращения ацетилхолина в холин. На первом этапе между СОО - глутамина и N  ацетилхолина возникает ионная связь, и возникает фермент-субстратный комплекс. Начинается вторая стадия.

После образования фермент-субстратного комплекса в действие вступают остальные аминокислоты, остатки активного центра. Между углеродом С=О группы ацетилхолина и кислородом ОН-группы серина возникает взаимодействие, т.е. возникает водородная связь между кислородом ацетилхолина и ОН-группы тирозина – эффект «дыбы».

Затем гистидин оттягивает протоны от ОН-группы серина. Вследствие этого упрочняется сложноэфирная связь между серином и остатком уксусной кислоты. Одновременно происходит разрыв другой сложноэфирной связи в молекуле ацетилхолина и переход протона от тирозина к остатку холина.

На третьем этапе холин высвобождается из активного центра. Его место занимает вода. Эта вода располагается между карбонильным кислородом ацетильной группы и кислородом тирозина. Фермент освобождён от продуктов реакции и готов к следующему циклу. На первом и последнем этапе продолжительность этапа зависит от скорости диффузии субстрата к ферменту или от фермента соответственно. Вторая стадия очень часто является лимитирующей весь процесс. Именно на этой стадии происходит снижение энергии активации реагирующих веществ.

Также существует ковалентный катализ – когда субстрат ковалентно связывается в активном центре фермента перед его превращением.

Биологическая химия Лелевич Владимир Валерьянович

Молекулярные механизмы ферментативного катализа

Механизмы ферментативного катализа определяются ролью функциональных групп активного центра фермента в химической реакции превращения субстрата в продукт.

Выделяют 2 основных механизма ферментативного катализа:

1. кислотно-основной катализ

2. ковалентный катализ.

Кислотно-основной катализ

Концепция кислотно-основного катализа объясняет ферментативную активность участием в химической реакции кислотных групп (доноры протонов) и/или основных групп (акцепторы протонов). Кислотно-основной катализ – часто встречающееся явление. Аминокислотные остатки, входящие в состав активного центра, имеют функциональные группы, проявляющие свойства как кислот, так и оснований.

К аминокислотам, участвующим в кислотно-основном катализе, в первую очередь относят Цис, Тир, Сер, Лиз, Глу, Асп и Гис. Радикалы этих аминокислот в протонированной форме – кислоты (доноры протона), в депротонированной – основания (акцепторы протона). Благодаря этому свойству функциональных групп активного центра ферменты становятся уникальными биологическими катализаторами, в отличие от небиологических катализаторов, способных проявлять либо кислотные, либо основные свойства.

Ковалентный катализ

Ковалентный катализ основан на атаке нуклеофильных (отрицательно заряженных) или электрофильных (положительно заряженных) групп активного центра фермента молекулами субстрата с формированием ковалентной связи между субстратом и коферментом или функциональной группой аминокислотного остатка (как правило, одной) активного центра фермента.

Действие сериновых протеаз, таких как трипсин, химотрипсин и тромбин, - пример механизма ковалентного катализа, когда ковалентная связь образуется между субстратом и аминокислотным остатком серина активного центра фермента. Термин «сериновые протеазы» связан с тем, что аминокислотный остаток серина входит в состав активного центра всех этих ферментов и участвует непосредственно в катализе. Рассмотрим механизм ковалентного катализа на примере химотрипсина, осуществляющего гидролиз пептидных связей при переваривании белков в двенадцатиперстной кишке. Субстратами химотрипсина служат пептиды, содержащие аминокислоты с ароматическими и циклическими гидрофобными радикалами (Фен, Тир, Три), что указывает на участие гидрофобных сил в формировании фермент-субстратного комплекса.